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11.4: Glicólise - Biologia

11.4: Glicólise - Biologia


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objetivos de aprendizado

Ao final desta seção, você será capaz de:

  • Explique como o ATP é usado pela célula como fonte de energia
  • Descreva o resultado geral em termos de moléculas produzidas da quebra da glicose por glicólise

Mesmo as reações exergônicas de liberação de energia requerem uma pequena quantidade de energia de ativação para prosseguir. No entanto, considere as reações endergônicas, que exigem muito mais energia, porque seus produtos têm mais energia livre do que seus reagentes. Dentro da célula, de onde vem a energia para alimentar essas reações? A resposta está em uma molécula fornecedora de energia chamada trifosfato de adenosina, ou ATP. O ATP é uma molécula pequena e relativamente simples, mas dentro de suas ligações contém o potencial para uma explosão rápida de energia que pode ser aproveitada para realizar o trabalho celular. Essa molécula pode ser considerada a principal moeda de energia das células, da mesma forma que o dinheiro é a moeda que as pessoas trocam por coisas de que precisam. O ATP é usado para alimentar a maioria das reações celulares que requerem energia.

ATP em sistemas vivos

Uma célula viva não pode armazenar quantidades significativas de energia livre. O excesso de energia livre resultaria em um aumento de calor na célula, o que desnaturaria enzimas e outras proteínas e, assim, destruiria a célula. Em vez disso, uma célula deve ser capaz de armazenar energia com segurança e liberá-la para uso apenas quando necessário. As células vivas conseguem isso usando ATP, que pode ser usado para preencher qualquer necessidade de energia da célula. Como? Ele funciona como uma bateria recarregável.

Quando o ATP é quebrado, geralmente pela remoção de seu grupo fosfato terminal, a energia é liberada. Essa energia é usada para fazer trabalho pela célula, geralmente pela ligação do fosfato liberado a outra molécula, ativando-a. Por exemplo, no trabalho mecânico de contração muscular, o ATP fornece energia para mover as proteínas musculares contráteis.

Estrutura e função de ATP

No coração do ATP está uma molécula de monofosfato de adenosina (AMP), que é composta por uma molécula de adenina ligada a uma molécula de ribose e a um único grupo de fosfato (Figura 1). Ribose é um açúcar de cinco carbonos encontrado no RNA e AMP é um dos nucleotídeos do RNA. A adição de um segundo grupo fosfato a esta molécula central resulta em difosfato de adenosina (ADP); a adição de um terceiro grupo fosfato forma trifosfato de adenosina (ATP).

A adição de um grupo fosfato a uma molécula requer uma grande quantidade de energia e resulta em uma ligação de alta energia. Os grupos fosfato são carregados negativamente e, portanto, se repelem quando estão dispostos em série, como no ADP e no ATP. Essa repulsão torna as moléculas de ADP e ATP inerentemente instáveis. A liberação de um ou dois grupos fosfato do ATP, um processo denominado hidrólise, libera energia.

Glicolise

Você leu que quase toda a energia usada pelos seres vivos chega até eles nas ligações do açúcar, a glicose. Glicolise é o primeiro passo na quebra da glicose para extrair energia para o metabolismo celular. Muitos organismos vivos realizam a glicólise como parte de seu metabolismo. A glicólise ocorre no citoplasma da maioria das células procarióticas e de todas as células eucarióticas.

A glicólise começa com a estrutura em forma de anel de seis carbonos de uma única molécula de glicose e termina com duas moléculas de um açúcar de três carbonos chamado piruvato. A glicólise consiste em duas fases distintas. Na primeira parte da via da glicólise, a energia é usada para fazer ajustes de forma que a molécula de açúcar de seis carbonos possa ser dividida igualmente em duas moléculas de piruvato de três carbonos. Na segunda parte da glicólise, são produzidos ATP e dinucleotídeo nicotinamida-adenina (NADH) (Figura 2).

Se a célula não pode catabolizar ainda mais as moléculas de piruvato, ela irá colher apenas duas moléculas de ATP de uma molécula de glicose. Por exemplo, glóbulos vermelhos maduros de mamíferos são apenas capazes de glicólise, que é sua única fonte de ATP. Se a glicólise for interrompida, essas células eventualmente morrerão.

Resumo da Seção

O ATP funciona como a moeda de energia para as células. Ele permite que as células armazenem energia brevemente e a transportem dentro de si para dar suporte às reações químicas endergônicas. A estrutura do ATP é a de um nucleotídeo de RNA com três grupos fosfato ligados. Como o ATP é usado para energia, um grupo fosfato é separado e o ADP é produzido. A energia derivada do catabolismo da glicose é usada para recarregar o ADP em ATP.

A glicólise é a primeira via usada na quebra da glicose para extrair energia. Por ser usado por quase todos os organismos da Terra, deve ter evoluído no início da história da vida. A glicólise consiste em duas partes: A primeira parte prepara o anel de seis carbonos da glicose para a separação em dois açúcares de três carbonos. A energia do ATP é investida na molécula durante esta etapa para energizar a separação. A segunda metade da glicólise extrai ATP e elétrons de alta energia dos átomos de hidrogênio e os anexa ao NAD+. Duas moléculas de ATP são investidas na primeira metade e quatro moléculas de ATP são formadas durante a segunda metade. Isso produz um ganho líquido de duas moléculas de ATP por molécula de glicose para a célula.

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Pergunta adicional de autoverificação

1. Os organismos procarióticos e eucarióticos realizam alguma forma de glicólise. Como esse fato apóia ou não a afirmação de que a glicólise é uma das vias metabólicas mais antigas?

Responder

1. Se a glicólise evoluísse relativamente tarde, provavelmente não seria tão universal nos organismos como é. Provavelmente evoluiu em organismos muito primitivos e persistiu, com a adição de outras vias do metabolismo de carboidratos que evoluíram posteriormente.

Tente

ATP: (também, trifosfato de adenosina), a moeda de energia da célula

glicolise: o processo de quebrar a glicose em duas moléculas de três carbonos com a produção de ATP e NADH


4.5 Conexões para outras vias metabólicas

Você aprendeu sobre o catabolismo da glicose, que fornece energia às células vivas. Mas os seres vivos consomem mais do que apenas glicose como alimento. Como um sanduíche de peru, que contém proteína, fornece energia para suas células? Isso acontece porque todas as vias catabólicas para carboidratos, proteínas e lipídios eventualmente se conectam à glicólise e às vias do ciclo do ácido cítrico (Figura 4.20). As vias metabólicas devem ser consideradas porosas - isto é, as substâncias entram por outras vias e outras substâncias saem por outras vias. Essas vias não são sistemas fechados. Muitos dos produtos em uma determinada via são reagentes em outras vias.

Conexões de outros açúcares com o metabolismo da glicose

Glicogênio, um polímero de glicose, é uma molécula de armazenamento de energia de curto prazo em animais. Quando há ATP adequado presente, o excesso de glicose é convertido em glicogênio para armazenamento. O glicogênio é produzido e armazenado no fígado e nos músculos. O glicogênio será retirado do estoque se os níveis de açúcar no sangue caírem. A presença de glicogênio nas células musculares como fonte de glicose permite que o ATP seja produzido por mais tempo durante o exercício.

A sacarose é um dissacarídeo feito de glicose e frutose unidas. A sacarose é decomposta no intestino delgado e a glicose e a frutose são absorvidas separadamente. A frutose é um dos três monossacarídeos da dieta, junto com a glicose e a galactose (que faz parte do açúcar do leite, o dissacarídeo lactose), que são absorvidos diretamente na corrente sanguínea durante a digestão. O catabolismo da frutose e da galactose produz o mesmo número de moléculas de ATP que a glicose.

Conexões de proteínas ao metabolismo da glicose

As proteínas são decompostas por uma variedade de enzimas nas células. Na maioria das vezes, os aminoácidos são reciclados em novas proteínas. Se houver excesso de aminoácidos, entretanto, ou se o corpo estiver em um estado de fome, alguns aminoácidos serão desviados para as vias de catabolismo da glicose. Cada aminoácido deve ter seu grupo amino removido antes de entrar nessas vias. O grupo amino é convertido em amônia. Nos mamíferos, o fígado sintetiza uréia a partir de duas moléculas de amônia e uma molécula de dióxido de carbono. Assim, a uréia é o principal produto residual em mamíferos do nitrogênio originado nos aminoácidos e sai do corpo na urina.

Conexões de lipídios ao metabolismo da glicose

Os lipídios que estão conectados às vias da glicose são o colesterol e os triglicerídeos. O colesterol é um lipídio que contribui para a flexibilidade da membrana celular e é um precursor dos hormônios esteróides. A síntese do colesterol começa com acetil CoA e prossegue em apenas uma direção. O processo não pode ser revertido e o ATP não é produzido.

Os triglicerídeos são uma forma de armazenamento de energia de longo prazo em animais. Os triglicerídeos armazenam cerca de duas vezes mais energia do que os carboidratos. Os triglicerídeos são feitos de glicerol e três ácidos graxos. Os animais podem produzir a maioria dos ácidos graxos de que precisam. Os triglicerídeos podem ser produzidos e decompostos em partes das vias de catabolismo da glicose. O glicerol pode ser fosforilado e segue através da glicólise. Os ácidos graxos são quebrados em unidades de dois carbonos que entram no ciclo do ácido cítrico.

Conexão de evolução

Vias de fotossíntese e metabolismo celular

A fotossíntese e o metabolismo celular consistem em várias vias muito complexas. Em geral, acredita-se que as primeiras células surgiram em um ambiente aquoso - uma “sopa” de nutrientes. Se essas células se reproduzissem com sucesso e seu número aumentasse constantemente, segue-se que as células começariam a esgotar os nutrientes do meio em que viviam, à medida que transferiam os nutrientes para suas próprias células. Essa situação hipotética teria resultado na seleção natural favorecendo os organismos que poderiam existir usando os nutrientes que permaneceram em seu ambiente e manipulando esses nutrientes em materiais que eles poderiam usar para sobreviver. Além disso, a seleção favoreceria aqueles organismos que poderiam extrair o valor máximo dos nutrientes disponíveis.

Desenvolveu-se uma forma inicial de fotossíntese que aproveitou a energia do sol usando compostos diferentes da água como fonte de átomos de hidrogênio, mas esta via não produzia oxigênio livre. Pensa-se que a glicólise se desenvolveu antes dessa época e poderia tirar proveito da produção de açúcares simples, mas essas reações não foram capazes de extrair totalmente a energia armazenada nos carboidratos. Uma forma posterior de fotossíntese usou água como fonte de íons de hidrogênio e gerou oxigênio livre. Com o tempo, a atmosfera tornou-se oxigenada. As coisas vivas se adaptaram para explorar esta nova atmosfera e permitiram que a respiração como a conhecemos evoluísse. Quando todo o processo de fotossíntese como o conhecemos se desenvolveu e a atmosfera tornou-se oxigenada, as células foram finalmente capazes de usar o oxigênio expelido pela fotossíntese para extrair mais energia das moléculas de açúcar usando o ciclo do ácido cítrico.


Lactato é um supressor natural de sinalização RLR por direcionamento MAVS

A produção de IFN tipo I mediada por RLR desempenha um papel fundamental na elevação da imunidade do hospedeiro para eliminação viral e vigilância imunológica do câncer. Aqui, relatamos que a glicólise, que é inativada durante a ativação do RLR, serve como uma barreira para impedir a produção de IFN tipo I após a ativação do RLR. O reconhecimento do MAVS-RIG-I desencadeado por RLR sequestra a ligação da hexoquinase ao MAVS, levando ao comprometimento da localização e ativação da mitocôndria da hexoquinase. O lactato atua como um metabólito-chave responsável pela inibição da sinalização RLR mediada pela glicólise, ligando-se diretamente ao domínio transmembranar (TM) do MAVS e evitando a agregação do MAVS. Notavelmente, a restauração de lactato reverte o aumento da produção de IFN causado pela deficiência de lactato. Usando abordagens farmacológicas e genéticas, mostramos que a redução do lactato pela inativação da lactato desidrogenase A (LDHA) aumenta a produção de IFN tipo I para proteger camundongos da infecção viral. Nosso estudo estabelece um papel crítico do lactato derivado da glicólise na limitação da sinalização de RLR e identifica o MAVS como um sensor direto de lactato, que funciona para conectar o metabolismo energético e a imunidade inata.

Palavras-chave: MAVS RLR sinalizando interferon lactato do metabolismo da glicose.


Portadores de elétrons

Em sistemas vivos, uma pequena classe de compostos funciona como lançadores de elétrons: eles se ligam e carregam elétrons de alta energia entre compostos nas vias. Os principais transportadores de elétrons que consideraremos são derivados do grupo da vitamina B e são derivados de nucleotídeos. Esses compostos podem ser facilmente reduzidos (ou seja, eles aceitam elétrons) ou oxidados (eles perdem elétrons). O dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD) (Figura 4.13) é derivado da vitamina B3, niacina. NAD + é a forma oxidada da molécula NADH é a forma reduzida da molécula após ter aceito dois elétrons e um próton (que juntos são o equivalente a um átomo de hidrogênio com um elétron extra).

NAD + pode aceitar elétrons de uma molécula orgânica de acordo com a equação geral:

RH (agente redutor) + NAD + (agente oxidante) & # 8212- & gt NADH (reduzido) + R (oxidado)

Quando os elétrons são adicionados a um composto, eles são reduzidos. Um composto que reduz outro é chamado de agente redutor. Na equação acima, RH é um agente redutor e NAD + é reduzido a NADH. Quando elétrons são removidos do composto, ele é oxidado. Um composto que oxida outro é chamado de agente oxidante. Na equação acima, NAD + é um agente oxidante e RH é oxidado a R.

Da mesma forma, o dinucleotídeo flavina adenina (FAD +) é derivado da vitamina B2, também chamada de riboflavina. Sua forma reduzida é FADH2. Uma segunda variação de NAD, NADP, contém um grupo fosfato extra. Tanto o NAD + quanto o FAD + são amplamente usados ​​na extração de energia de açúcares, e o NADP desempenha um papel importante nas reações anabólicas e na fotossíntese.

Figura 4.13 A forma oxidada do portador de elétrons (NAD +) é mostrada à esquerda e a forma reduzida (NADH) é mostrada à direita. A base nitrogenada do NADH tem mais um íon hidrogênio e mais dois elétrons do que no NAD +.

Resultados da glicólise

Uma molécula de glicose produz quatro ATP, dois NADH e duas moléculas de piruvato durante a glicólise.

Objetivos de aprendizado

Descreva a energia obtida de uma molécula de glicose passando pela glicólise

Principais vantagens

Pontos chave

  • Embora quatro moléculas de ATP sejam produzidas na segunda metade, o ganho líquido da glicólise é de apenas dois ATP porque duas moléculas de ATP são usadas na primeira metade da glicólise.
  • As enzimas que catalisam as reações que produzem ATP são etapas limitantes da taxa de glicólise e devem estar presentes em quantidades suficientes para que a glicólise complete a produção de quatro ATP, dois NADH e duas moléculas de piruvato para cada molécula de glicose que entra na via.
  • Os glóbulos vermelhos requerem glicólise como única fonte de ATP para sobreviver, porque não possuem mitocôndrias.
  • As células cancerosas e as células-tronco também usam a glicólise como a principal fonte de ATP (processo conhecido como glicólise aeróbia ou efeito Warburg).

Termos chave

  • piruvato: qualquer sal ou éster de ácido pirúvico, o produto final da glicólise antes de entrar no ciclo de TCA

Resultados da glicólise

A glicólise começa com uma molécula de glicose e termina com duas moléculas de piruvato (ácido pirúvico), um total de quatro moléculas de ATP e duas moléculas de NADH. Duas moléculas de ATP foram usadas na primeira metade da via para preparar o anel de seis carbonos para clivagem, de modo que a célula tem um ganho líquido de duas moléculas de ATP e 2 moléculas de NADH para seu uso. Se a célula não consegue catabolizar mais as moléculas de piruvato (por meio do ciclo do ácido cítrico ou do ciclo de Krebs), ela coletará apenas duas moléculas de ATP de uma molécula de glicose.

A glicólise produz 2 moléculas de ATP, 2 NADH e 2 moléculas de piruvato: A glicólise, ou decomposição catabólica aeróbia da glicose, produz energia na forma de ATP, NADH e piruvato, que por sua vez entra no ciclo do ácido cítrico para produzir mais energia.

Os glóbulos vermelhos de mamíferos maduros não têm mitocôndrias e não são capazes de respiração aeróbica, processo pelo qual os organismos convertem energia na presença de oxigênio. Em vez disso, a glicólise é sua única fonte de ATP. Portanto, se a glicólise for interrompida, os glóbulos vermelhos perdem a capacidade de manter suas bombas de sódio-potássio, que requerem ATP para funcionar, e, eventualmente, morrem. Por exemplo, uma vez que a segunda metade da glicólise (que produz as moléculas de energia) diminui ou pára na ausência de NAD +, quando NAD + não está disponível, os glóbulos vermelhos serão incapazes de produzir uma quantidade suficiente de ATP para sobreviver.

Além disso, a última etapa da glicólise não ocorrerá se a piruvato quinase, a enzima que catalisa a formação do piruvato, não estiver disponível em quantidades suficientes. Nesta situação, todo o caminho da glicólise continuará a prosseguir, mas apenas duas moléculas de ATP serão feitas na segunda metade (em vez das quatro moléculas de ATP usuais). Assim, a piruvato quinase é uma enzima limitante da taxa de glicólise.


A enzima triosefosfato isomerase converte rapidamente as moléculas de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) e gliceraldeído 3-fosfato (GAP). O fosfato de gliceraldeído é removido / usado na próxima etapa da glicólise.

Detalhes:

GAP é a única molécula que continua na via glicolítica. Como resultado, todas as moléculas de DHAP produzidas são posteriormente atuadas pela enzima Triosefosfato isomerase (TIM), que reorganiza o DHAP em GAP para que ele possa continuar na glicólise. Neste ponto da via glicolítica, temos duas moléculas de 3 carbonos, mas ainda não convertemos totalmente a glicose em piruvato.


Respiração celular estágio II: o ciclo de Krebs

Lembre-se de que a glicólise produz duas moléculas de piruvato (ácido pirúvico), que são então convertidas em acetil CoA durante a curta reação de transição. Essas moléculas entram na matriz de uma mitocôndria, onde começam a ciclo de Krebs (também conhecido como Ciclo do Ácido Cítrico). A razão pela qual esse estágio é considerado um ciclo é porque uma molécula chamada oxaloacetato está presente no início e no final dessa reação e é usada para quebrar as duas moléculas de acetil CoA. As reações que ocorrem a seguir são mostradas na Figura 4.10.6.

Figura 4.10.6 Reagentes e produtos do Ciclo de Krebs.

O próprio ciclo de Krebs começa quando o acetil-CoA se combina com uma molécula de quatro carbonos chamada OAA (oxaloacetato) (ver Figura 4.10.6). Isso produz ácido cítrico, que possui seis átomos de carbono. É por isso que o ciclo de Krebs também é chamado de ciclo do ácido cítrico.

Após a formação do ácido cítrico, ele passa por uma série de reações que liberam energia. A energia é capturada em moléculas de NADH, ATP e FADH2, outra coenzima carregadora de energia. O dióxido de carbono também é liberado como um produto residual dessas reações.

A etapa final do ciclo de Krebs regenera OAA, a molécula que iniciou o ciclo de Krebs. Essa molécula é necessária para a próxima curva do ciclo. Duas voltas são necessárias porque a glicólise produz dois moléculas de ácido pirúvico quando ele divide a glicose.


11.2.3 Resultados da glicólise

A glicólise começa com glicose e termina com dois piruvato moléculas, um total de quatro moléculas de ATP e duas moléculas de NADH. Como duas moléculas de ATP foram investidas no primeiro estágio da via, a célula tem um ganho líquido de 2 moléculas de ATP e 2 moléculas de NADH. Se a célula não pode catabolizar ainda mais as moléculas de piruvato, ela irá colher apenas duas moléculas de ATP de uma molécula de glicose.

REVISÃO RÁPIDA DA GLICÓLISE:

    • Divide uma molécula de glicose de seis carbonos em 2 moléculas de três carbonos de piruvato, usando 10 reações catalisadas por enzimas
    • Rende um ganho líquido de 2 ATP e 2 NADH
    • Ocorre no citoplasma
    • Pode ocorrer sem oxigênio é um processo anaeróbico

    Etapa 7: Conversão de 1,3-Bifosfoglicerato em 3-Fosfoglicerato

    • A enzima fosfoglicerato quinase transfere o grupo fosforila de alta energia do grupo carboxila do 1,3-bisfosfoglicerato para o ADP, formando ATP e 3-fosfoglicerato.
    • Este é um exemplo único em que o ATP pode ser produzido no nível do substrato sem participar da cadeia de transporte de elétrons. Este tipo de reação em que o ATP é formado no nível do substrato é chamado de fosforilação no nível do substrato.

    Materiais e métodos

    Cepas, meios e condições de cultivo

    Nós costumavamos S. cerevisiae cepa T73 (CECT 1894) isolada de Alicante (Espanha) mostos [48], que é comercializada pela Lallemand Inc. (Montreal, Canadá). Esta cepa tem sido amplamente utilizada em diversos estudos e tem se mostrado um bom modelo de levedura para vinho. Esta cepa foi previamente modificada geneticamente para T73ura3 [49] para construir outras cepas, dada a ausência de auxotrofias em leveduras naturais do vinho. Essas cepas também são aneuplóides e têm um número de cromossomos que não é um múltiplo do número haplóide, e requerem várias rodadas de transformação para a construção do gene de deleção.

    O plasmídeo YEp-TRX2 foi obtido por subclonagem de um 0.7 kb Eco Fragmento RI contendo a levedura TRX2 gene e promotor no plasmídeo de levedura epissomal Yep352 carregando um marcador selecionável URA3. O TTRX2 cepa [2] é um T73 geneticamente modificadoura3 cepa seguindo o procedimento de acetato de lítio modificado por [50].

    Tensão trx2 foi obtido por deleção sequencial das duas cópias do TRX2 gene na cepa T73ura3. A interrupção foi realizada por recombinação homóloga em ambas as extremidades do TRX2 quadro de leitura aberto de um cassete de integração carregando um kanR gene marcador flanqueado por loxP sites. A excisão do marcador é induzida pela expressão de Cre recombinase introduzida na mesma cepa [51] para permitir interrupções repetidas. Integração da cassete no TRX2 locus e posterior excisão do kanR marcadores foram confirmados por análise de PCR. A ausência de qualquer TRX2 produto do gene foi confirmado por análises de Northern blot e Western blot. A prototrofia de uracila foi restaurada pela introdução de um 1,1 kb Traseiro III fragmento linear contendo o URA3 gene.

    Pré-culturas para experimentos de propagação de biomassa industrial foram preparadas em meio líquido YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose) e incubadas a 30 ° C com agitação (250 rpm) por 12 h.

    O meio de melaço (diluído para 60 g de sacarose L -1 para a fase de lote ou 100 g de sacarose L -1 para a fase de lote alimentado) foi suplementado com 7,5 g L -1 de (NH4)2TÃO4, 3,5 g L -1 de KH2PO4, 0,75 g L -1 de MgSO47h2O, 10 ml L -1 de solução vitamínica e 1 ml L -1 de antiespumante 204 (Sigma, St. Louis, Mo.). O melaço e as soluções minerais foram autoclavados separadamente. A solução vitamínica contendo 50 mg L -1 de D-biotina, 1 g L -1 de pantotenato de cálcio e 1 g L -1 de cloridrato de tiamina foi esterilizada por filtração (tamanho de poro de 0,2 μm) antes do uso no meio de melaço.

    O meio líquido YPGF (1% extrato de levedura, 2% peptona, 10% glicose, 10% frutose) foi usado para inocular levedura fresca e levedura seca ativa produzida em condições industriais para simular o teor de açúcar do mosto e as condições de fermentação do vinho. O meio YPGF também foi suplementado com o indutor de carbonilação glioxal (GO) a 5 mM por 1 h para induzir danos à carbonilação de proteínas [32].

    Condições de produção industrial

    Os experimentos de propagação de biomassa foram projetados com dois estágios de crescimento, lote e lote alimentado, em um biorreator BIOFLO III (NBS, New Jersey), e os parâmetros técnicos (agitação, pH e taxa de alimentação) foram estabelecidos conforme descrito anteriormente [1, 3, 29]. As pré-culturas YPD durante a noite foram incubadas a 30 ° C com agitação (250 rpm) (Tempo 0 h). O biorreator contendo 2 L de meio de melaço esterilizado em pH 4,5 foi então inoculado para um OD inicial600 nm de 0,05. Na fase de lote, as células consumiram toda a sacarose presente no meio por meio de um metabolismo fermentativo. Com o esgotamento da sacarose (12-15 h), as células mudaram seu metabolismo para a respiração, permitindo o consumo do etanol produzido até aproximadamente 40 h do processo. Quando o etanol foi exaurido, a fase descontínua alimentada começou alimentando o reator continuamente com meio de melaço na taxa de fluxo desejada até aproximadamente 80 h, evitando assim o metabolismo fermentativo a fim de obter o maior rendimento de biomassa. Três experimentos de produção independentes foram realizados para o T73, TTRX2 e trx2 Deformação.

    Secagem e reidratação de biomassa

    No final da fermentação descontínua alimentada, a biomassa foi separada por centrifugação do meio fermentado e submetida a várias etapas de lavagem com água destilada. Biomassa concentrada (500 mg) foi coletada em placas de Petri. A biomassa da levedura foi desidratada sob fluxo de ar em um forno de convecção a 30 ° C até aproximadamente 8% de umidade relativa (aproximadamente 24 h) com placas de petri abertas [3]. A biomassa desidratada foi coletada em sacos plásticos e armazenada a vácuo em temperatura ambiente durante uma semana. A reidratação foi realizada em água destilada a 37 ° C durante 10 min em condições estáticas e 10 min com agitação a 130 rpm [52].

    Extração de proteínas e eletroforese em gel bidimensional

    Amostras de células (25 mg) foram coletadas às 0h, 15h e 80h de crescimento para extração de proteína. As células foram ressuspensas em 150 μL de tampão de extração (8 M de uréia, 25 mM de Tris-HCl pH 8,0), uma mistura de inibidores de protease (200 μM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 20 μM de TPcK, 200 μM de pepstatina A) e 0,2 g de vidro miçangas. As células foram quebradas em Fast Prep (MP Bio) a 5,0 m / s por 45 segundos em 3 ocasiões. Após centrifugação a 12000 rpm por 10 min, o sobrenadante foi sonicado e centrifugado novamente a 12000 rpm por 10 min. A concentração de proteína foi determinada com um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 UV / Vis. Entre 50-80 μg de proteína foram diluídos em 340 μl de tampão de reidratação (8 M de uréia, 4% de CHAPS (p / v), 50 mM de DTT e 0,5% de anfólitos (v / v) pH 3-10 (Amersham)). A focalização isoelétrica (50-100 μg de proteína) foi realizada em tiras de gradiente de pH imobilizadas (3-11 NL Amersham). Após a primeira dimensão, as tiras foram incubadas por 20 min com 5 ml de uma solução contendo 10 mM de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) em 10% de ácido trifluoroacético (TFA). Este composto reage com grupos carbonil em proteínas. Para parar esta reacção, a tira foi transferida para uma solução de 5 ml contendo Tris 0,4 M, Ureia 6 M, SDS a 2% e glicerol a 20%. O SDS-PAGE de segunda dimensão foi realizado em géis de poliacrilamida a 11% de 18 x 18 cm.

    Quatro tiras foram executadas em paralelo, duas tiras para o tipo selvagem e duas tiras para a respectiva cepa mutante de cada vez. Os géis foram transferidos para membranas de PVDF para análise de western blot ou coados com prata e escaneados em um densitômetro GS800 (Bio-Rad). Em ambos os casos, as imagens obtidas foram analisadas com o software PDQuest (Bio-Rad). Os géis foram corados com prata usando o kit de coloração com prata PlusOne da General Electric Healthcare. As membranas de PVDF foram coradas com prata para controlar a carga de proteína, conforme descrito em outro lugar [53].

    Análise de Western blot e quantificação do conteúdo de carbonil

    Os extratos brutos foram separados em géis de SDS-poliacrilamida a 10% e transferidos para a membrana de PVDF dos géis unidimensionais. Um anticorpo policlonal anti-Adh1p foi adquirido da Acris (R1049) que é capaz de detectar formas monômero, dímero e tetrâmero de Adh1p sob condições SDS / PAGE conforme descrito no site http://www.acris-antibodies.com/antibodies /r1049.htm e diluído para 1: 1000. Os Western blots de géis bidimensionais foram preparados conforme descrito na seção anterior. Foi usada uma diluição 1: 5000 de anticorpo contra DNP (Dako). Em ambos os casos, um anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase foi usado para detecção. As imagens foram adquiridas em um sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad) e analisadas com o software Quantity One (Bio-Rad).

    O conteúdo de carbonil foi quantificado por meio do software PDQuest (Bio-Rad). Os níveis de carbonilação para cada proteína são calculados dividindo a intensidade da carbonila do 2-D anti DNP ocidental (Ceu) por intensidade de proteína (Peu) a partir de géis corados com prata 2-D.

    Identificação de proteínas por digestão tríptica e MALDI-TOF

    Manchas de proteína foram excisadas de géis e submetidas a no local digestão com tripsina em um ZipPlate (Millipore). Pedaços de gel foram lavados com bicarbonato de amônio 25 mM e desidratados com acetonitrila seguido por (i) redução de cisteínas com DTT 10 mM, (ii) alquilação de cisteínas livres com iodoacetamida 55 mM, e (iii) no local digestão com 170 ng de tripsina durante a noite a 30 ° C. Extrações de peptídeos e lavagens foram realizadas em um ZipPlate seguindo as recomendações do fabricante. Os péptidos trípticos foram recuperados em 5 ml de 0,1% TFA, 50% acetonitrilo e colocados numa placa MALDI na presença de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico. Os espectros foram obtidos em um aparelho Applied Biosystems voyager DE PRO MALDI-TOF operando no modo refletor. Os espectros com resoluções superiores a 8.000 foram obtidos. A calibração externa foi realizada com misturas de calibração da Applied Biosystems. Os espectros adquiridos foram processados ​​pelo Data Explorer (versão 4.0). As proteínas foram identificadas por impressão digital em massa de peptídeos pesquisando no banco de dados Swiss-Prot usando MASCOT. A cobertura de proteína para cada ponto na análise MASCOT de até 50 por cento foi considerada significativa. Alternativamente, as proteínas foram identificadas por combinação de gel com S. cerevisiae Mapas bidimensionais de eletroforese em gel disponíveis nas seguintes bases de dados: YPD (Yeast Proteome Database http://www.proteome.com) YMP (Yeast Mitochondrial Proteome http://www.biochem.oulu.fi/proteomics/ymp.html) e 2-DE S. cerevisiae (IPG6-12) http://www.weihenstephan.de/proteomik/. A análise de grupo funcional foi realizada usando os aplicativos online GOstat e GO term finder (banco de dados SGD) com uma taxa de descoberta falsa de 5%. Os dados representados correspondem à média de três repetições biológicas.

    Imunoprecipitação ADH

    As células em tampão IP (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, glicerol a 10%, Nonidet-P40 a 0,1%) mais inibidores de protease 1X (Roche) e PMSF 0,4 mM foram quebradas com 0,5 g de vidro esferas em um Fast Prep (MP Bio) a 5,0 m / s por 45 s, 3 vezes. Os lisados ​​foram clarificados por centrifugação por 15 min a 14.000 rpm e adicionados a 20 μl de grânulos de proteína A / G PLUS-Agarose (Santa Cruz Biotechnology, INC) com anticorpo policlonal anti-ADH ligado (anticorpos Acris). Após uma etapa de ligação de 4 h a 4 ° C, as contas foram lavadas três vezes com tampão IP mais TritonX-100 0,5% e NaCl 0,5 mM e ressuspensas em tampão de derivatização de carbonil (Imidazol 25 mM, EDTA 2 mM, pH 7,0, SDS 6% , Inibidor de protease 1X) e fervido 3 min. As proteínas da amostra foram derivatizadas com DNPH e separadas em gel de acrilamida 9% (BioRad Laboratories) e incubadas com anticorpo anti-DNP a 1/3500 e anti-coelho (1/5000).

    Atividades enzimáticas

    As células desidratadas foram inoculadas (10 7 células / mL) em YPGF e incubadas a 30 ° C e 65 rpm por 5 h. As amostras foram coletadas no final da incubação e os extratos celulares foram preparados usando contas de vidro e ensaiados conforme descrito nas seguintes referências: álcool desidrogenase [54], enolase [55], piruvato descarboxilase [56] e catalase [57].


    Assista o vídeo: Respiração Celular Parte 1 - Glicólise. Biologia com Samuel Cunha (Dezembro 2022).